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南京医科大学学报（自然科学版） 第41卷第10期
·1542 · Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） 2021年10月

·临床医学·

采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究

马 玲 ，刘太香，薛 敏
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江苏省血液中心输血研究室，江苏 南京 210042

［摘 要］ 目的：建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法：根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成
序列特异性引物，在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析，根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断，并与
常规序列特异性引物PCR（PCR⁃sequence specific primer，PCR⁃SSP）RHD c.1227G>A 基因分型方法进行比较；对与血清学结果
不一致的标本进行测序分析。结果：在 87 例血清学初筛为 RhD 阴性表型的标本中，采用熔解曲线分析法，检测出 16 例含有
RHD c.1227G>A，占比18.4%；与常规PCR⁃SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测
序分析，证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%，约登指
数为1.0。结论：成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法，可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A
基因检测研究。

［关键词］ 熔解曲线；RHD基因；RHD c.1227G>A
［中图分类号］ R446.7 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2021）10⁃1542⁃04
doi：10.7655/NYDXBNS20211023

Rh 血型系统因其复杂多态性及临床重要性而 妇可以免去孕期频繁的抗体筛查和抗D免疫球蛋白
备受关注，其中RhD抗原免疫原性最强，相应的抗D 注射 ［5-6］ ，这一理论如果获得推广应用无疑有良好的
是导致胎儿新生儿严重溶血的最主要抗体，因而 社会效益。因而，研究第一步，建立 RHD c.1227G>
［1］
RhD 阴性孕妇妊娠及血液安全管理需格外重视 。 A基因位点高效、便捷的检测方法十分必要。
RhD 抗原存在诸多的变异型，根据红细胞膜上 D 抗 常规Del表型的血清学检测是通过吸收放散的
原表达的数目和性质，大致可分为弱D、部分D以及 方法，该操作步骤较繁琐，对检测人员的手法和经
东亚人群常见的Del型等。各种RhD变异型基因背 验有一定要求，易导致差错。随着DEL型分子机制
景机制不一，免疫原性也不相同，尤其是Del表型的 的阐明，血型基因检测方法的发展为DEL型鉴定提
检测及个体RhD 抗原免疫应答情况值得重视。Del 供了新的技术手段。本研究旨在建立用于检测
表型最初由Okubo等 报道，其D抗原表达非常弱， RHD c.1227G>A 基因分型的熔解曲线分析法，该方
［2］
每个红细胞膜上D抗原拷贝数低于200个 ，常规血 法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔
［3］
清学检测不出，需要通过吸收放散技术才能检测 解曲线，具有较高的敏感性，可以检测出单个碱基
到。有调查发现东亚人群中初筛为 RhD 阴性者中 的差异，同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、
17%~30%为 Del 型，其中约 98%的分子遗传背景为 成像等操作，缩短了检测时间，且减少了 PCR 产物

RHD 基 因 exon 9 c.1227G>A 同 义 突 变（RHD* 交叉污染的可能性，现报道如下。
［4］
01EL.01） ，因此该型又被称为亚洲型 DEL 血型
1 材料和方法
（Asia type DEL 血型）。有研究报道在亚洲型 DEL
孕妇中，均未发现抗D抗体产生，因此提议，Del型孕 1.1 材料
1.1.1 样本来源
2018 年 10 月—2020 年 1 月于本中心进行产前
［基金项目］ 江苏省输血协会英科新创科研基金（JS2018
检查的孕妇 87 例，年龄 21~41 岁，中位年龄 29 岁；
014）
RhD 初筛试验结果均为阴性，采外周静脉 EDTA 抗
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通信作者（Corresponding author），E⁃mail：mlinsmile@hotmail.
com 凝血约 3 mL；经本人知情同意，且研究经本中心伦