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南京医科大学学报(自然科学版)                                 第41卷第10期
               ·1542 ·                    Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences)  2021年10月


             ·临床医学·

              采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究



              马   玲 ,刘太香,薛 敏
                    *
              江苏省血液中心输血研究室,江苏 南京               210042




             [摘    要] 目的:建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法:根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成
              序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与
              常规序列特异性引物PCR(PCR⁃sequence specific primer,PCR⁃SSP)RHD c.1227G>A 基因分型方法进行比较;对与血清学结果
              不一致的标本进行测序分析。结果:在 87 例血清学初筛为 RhD 阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出 16 例含有
              RHD c.1227G>A,占比18.4%;与常规PCR⁃SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测
              序分析,证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%,约登指
              数为1.0。结论:成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A
              基因检测研究。

             [关键词] 熔解曲线;RHD基因;RHD c.1227G>A
             [中图分类号] R446.7                   [文献标志码] A                       [文章编号] 1007⁃4368(2021)10⁃1542⁃04
              doi:10.7655/NYDXBNS20211023





                  Rh 血型系统因其复杂多态性及临床重要性而                         妇可以免去孕期频繁的抗体筛查和抗D免疫球蛋白
              备受关注,其中RhD抗原免疫原性最强,相应的抗D                          注射  [5-6] ,这一理论如果获得推广应用无疑有良好的
              是导致胎儿新生儿严重溶血的最主要抗体,因而                             社会效益。因而,研究第一步,建立 RHD c.1227G>
                                                         [1]
              RhD 阴性孕妇妊娠及血液安全管理需格外重视 。                          A基因位点高效、便捷的检测方法十分必要。
              RhD 抗原存在诸多的变异型,根据红细胞膜上 D 抗                             常规Del表型的血清学检测是通过吸收放散的
              原表达的数目和性质,大致可分为弱D、部分D以及                           方法,该操作步骤较繁琐,对检测人员的手法和经
              东亚人群常见的Del型等。各种RhD变异型基因背                          验有一定要求,易导致差错。随着DEL型分子机制
              景机制不一,免疫原性也不相同,尤其是Del表型的                          的阐明,血型基因检测方法的发展为DEL型鉴定提
              检测及个体RhD 抗原免疫应答情况值得重视。Del                         供了新的技术手段。本研究旨在建立用于检测
              表型最初由Okubo等 报道,其D抗原表达非常弱,                         RHD c.1227G>A 基因分型的熔解曲线分析法,该方
                                 [2]
              每个红细胞膜上D抗原拷贝数低于200个 ,常规血                          法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔
                                                   [3]
              清学检测不出,需要通过吸收放散技术才能检测                             解曲线,具有较高的敏感性,可以检测出单个碱基
              到。有调查发现东亚人群中初筛为 RhD 阴性者中                          的差异,同时避免了常规PCR方法后续上样、电泳、
              17%~30%为 Del 型,其中约 98%的分子遗传背景为                    成像等操作,缩短了检测时间,且减少了 PCR 产物

              RHD 基 因 exon 9 c.1227G>A 同 义 突 变(RHD*             交叉污染的可能性,现报道如下。
                      [4]
              01EL.01) ,因此该型又被称为亚洲型 DEL 血型
                                                                1  材料和方法
             (Asia type DEL 血型)。有研究报道在亚洲型 DEL
              孕妇中,均未发现抗D抗体产生,因此提议,Del型孕                         1.1  材料
                                                                1.1.1 样本来源
                                                                     2018 年 10 月—2020 年 1 月于本中心进行产前
             [基金项目] 江苏省输血协会英科新创科研基金(JS2018
                                                                检查的孕妇 87 例,年龄 21~41 岁,中位年龄 29 岁;
              014)
                                                                RhD 初筛试验结果均为阴性,采外周静脉 EDTA 抗
              ∗
               通信作者(Corresponding author),E⁃mail:mlinsmile@hotmail.
              com                                               凝血约 3 mL;经本人知情同意,且研究经本中心伦
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