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第41卷第10期
·1544 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2021年10月

性；只有β⁃actin峰时，判定为RHD exon 9 c.1227G>A 2.3 熔解曲线法与PCR⁃SSP方法比较
阴性；无β⁃actin 峰时，判为试验无效（图 1）。共计 87 例样本同步采用商品化 RHD 阴性鉴定基因
16 例 样 本 检 测 出 含 有 RHD c.1227G>A（占 比 检测试剂盒（PCR⁃SSP 法）进行检测，将熔解曲线法
18.4%）。 结果与之比较，结果一致，相同的 16 例样本均含有

A 0.70 RHD c.1227G>A B 0.45 β⁃actin
（ 导数转换 ） 0.50 β⁃actin （ 导数转换 ） 0.35
0.60
0.40
0.30
0.40
0.25
0.30
0.20
荧光值 0.20 荧光值 0.15
0.10
0.10
0.00
0.05
0.00
-0.10
-0.05
60 65 70 75 80 85 90 95 60 65 70 75 80 85 90 95
温度（℃） 温度（℃）
A：RHD exon 9 c.1227G>A（+）；B：RHD exon 9 c. 1227G>A（-）。
图1 RHD c.1227G>A 及β⁃actin基因扩增的熔解曲线
RHD c.1227G>A（χ =0.038，P=0.845）。 研 究 ；故 本 研 究 旨 在 建 立 高 效 、便 捷 的 RHD
2
2.4 测序结果 c.1227G>A等位基因检测方法。
对 1 例吸收放散试验结果为阴性，基因检测结 本研究首先对于 RhD 抗原确认结果为阴性的
果为阳性的样本进行RHD外显子9测序分析，证实 样本进行吸收放散试验，该操作步骤较为繁琐，对
含有c.1227G>A（图2）。 检测人员的手法和经验有一定要求，操作不当易产
2.5 方法学评价 生错误结果。本次试验血清学检测出 15 例 Del 表
统计结果显示，采用熔解曲线分析法检测RHD 型，另有 1 例标本经荧光定量 PCR 熔解曲线分析及
c.1227G>A位点的灵敏度为100%，特异度为100%， PCR⁃SSP 的方法表明为亚洲型 DEL，后经测序方法
阳性预测值为100%，阴性预测值为100%，约登指数 证实。该样本血清学方法漏检可能原因是样本保
为1.0，总符合率达100%。 存时间过长或吸收方法试验操作不熟练，因样本量
不足，未进行血清学重复验证。
G G A A A G T A A
血清学方法只能检测出 Del 表型，并不能明确
其分子机制。现已知导致Del表型的等位基因已超
过 17 个 ，如 RHD（IVS3 + 1A）、RHD c.3G>A、RHD
c.1227G>A 等 ［11］ 。 对 于 中 国 人 最 常 见 的 RHD
c.1227G>A检测，常用的检测手段为PCR⁃SSP法，但
c.1227G>A 该方法的不足之处在于 PCR 结束后，需开盖上样、
图2 某样本RHD exon 9测序结果
电泳、成像等操作，耗时较长，且增加了产物交叉污
染的风险；而熔解曲线分析法是一种PCR后产物分
3 讨 论
析技术，利用双链 DNA 在升温过程中，由于长度、
亚洲型 DEL 血型的分子遗传背景为 RHD 基因 GC含量等因素而产生不同的解离特征，结合荧光检
exon 9 存在 c.1227G>A 同义突变，由于 1 227 位为 测，在闭管环境下，由仪器自动实现对单核苷酸多
exon 9 3′端最后1位碱基，该突变虽未导致氨基酸的 态性鉴别分析，避免人为判断误差，具有操作简单、
变化，但可能影响 mRNA 的正常拼接或拼接效率， 结果判断直观等特点，现已广泛用于基因分型、甲
导致RHD基因表达水平降低，这也一定程度上解释 基化检测等研究。熔解曲线分析技术可分为探针
了为何 Del 表型 RhD 抗原表位没有变化，但抗原数 熔解曲线（probe melting curve）和荧光染料熔解曲线
量却明显减少 ［10］ 。用于Del血型检测的吸收放散试 （fluorescent dye melting curve）两大类。Sun 等 ［12］ 报
验并未常规用于临床检测，因此 Del 表型个体一直 道了一种荧光探针熔解曲线分析法，可同时检测
被当成 RhD 阴性对待。Del 表型个体，尤其是亚洲 RHD 1227G和RHD 1227A等位基因，该方法难点在
型 DEL 的检测及个体 RhD 抗原免疫应答情况值得 于“锚定探针”和“检测探针”的合理设计，如何实现