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第41卷第10期             马  玲,刘太香,薛 敏. 采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究[J].
                 2021年10月                    南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(10):1542-1545                      ·1543 ·


                理委员会批准。                                           10 min,之后95 ℃ 变性15 s,60 ℃退火延伸 1 min共
                1.1.2 主要试剂和仪器                                     40 个循环。所有反应均设 3 个复孔,并以水为模板
                     IgG/IgM 型抗 D 试剂(Sanquin 公司,荷兰);IgG           设空白对照。PCR 反应结束后,使用仪器默认的熔
                型抗D 试剂(上海血液生物医药有限责任公司);基                          解曲线分析程序(95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,
                因组 DNA 提取试剂盒(北京原平皓生物公司);2×                        60 ℃ 15 s)进行分析,期间连续监测荧光信号,根据
                Taq PCR Mix(南京博尔迪生物科技有限公司);                       熔解温度(melting temperature,Tm)值的差异进行基
                SYBR Green Master(Roche,瑞士);人类红细胞 RhD             因分型。
                基因分型试剂盒(PCR⁃SSP)(天津秀鹏生物技术);                       1.2.5 对比研究
                Labofuge 400R 低温高速离心机(Heraeus 公司 德                    采用商品化 RHD 阴性鉴定基因检测试剂盒
                国);ND⁃100⁃Spectrophotometer DNA 定量分析仪            (PCR⁃SSP 法)对上述标本进行同步检测,严格按说
               (NanoDrop 公司 美国);Alphalmager HP 凝胶成像系              明书操作。PCR 反应条件为:96 ℃ 2 min,随后
                统、ABI 7300扩增仪(Applied Biosystem公司,美国)。            96 ℃ 20 s,68 ℃ 60 s,5 个循环;96 ℃ 20 s,65 ℃ 50 s,

                1.2  方法                                           72 ℃ 45 s,10 个循环;96 ℃ 20 s,62 ℃ 50 s,72 ℃
                1.2.1 血清学试验                                       45 s,15 个循环;72 ℃ 5 min,最后4 ℃保存。PCR扩
                    采用间接抗人球试验的方法,使用 3~4 种不同                       增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳(100 V,30 min),用
                克隆的 IgG 或 IgM/IgG 型抗 D 试剂进行 RhD 阴性确               凝胶成像系统分析结果。
                认。对于结果为阴性的样本进行吸收放散试验,检                            1.2.6 RHD基因测序
                                                          [7]
                测是否为 Del 型。具体操作步骤参考文献方法 并                             参考文献方法 ,对 RHD 外显子 9 进行测序分
                                                                                   [9]
                略为修改,吸收用试剂为IgG/IgM型抗D与IgG型抗                       析,PCR 总体积为 20 μL,引物浓度为 200 nmol/L,
                D试剂混合使用,吸收时间为1 h。                                 PCR 条件为:95 ℃,5 min;95 ℃ 30 s,61 ℃ 30 s,
                1.2.2 引物设计                                        72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR
                    查找GenBank数据库中RHD基因序列(序列号                      产物经纯化后直接进行测序分析,测序引物同扩增
                为NG007494),针对1227A特异性位点,应用Primer                  引物。使用 Sequencing Analysis 6 和 SeqScape v3.0
                5 引物设计软件进行扩增引物设计。经过预实验,                           软件进行测序图谱分析和序列比对。
                优化后的引物序列参见表1。另采用引物β⁃actin作                        1.3  统计学方法
                          [8]
                为内参序列 。                                               采用SPSS 19.0软件进行数据分析,计数资料采
                                                                  用例数和构成比进行统计描述,并通过配对χ 检验
                                                                                                           2
                           表1 荧光定量PCR所用引物
                                                                  比较熔解曲线法与PCR⁃SSP 法结果的差异;采用灵
                基因           引物序列(5′→3′)           产物大小(bp)
                                                                  敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和
                1227A   F:GACCAAGTTTTCTGGAAA           140
                                                                  约登指数等指标对熔解曲线法进行评判。P < 0.05
                        R:ATGCTCCTTACTCCATTTT
                                                                  为差异有统计学意义。
                β⁃actin  F:GCG CCG TTC CGA AAG TT      137
                        R:CGG CGG ATC GGC AAA
                                                                  2  结 果
                1.2.3 基因组DNA提取                                    2.1  血清学结果
                    离心吸取孕妇白膜层细胞,按照DNA提取试剂                             87例标本中,RhD确认试验结果阳性者6例;对

                盒操作要求提取基因组DNA,采用ND⁃100⁃Spectro⁃                   其余81例标本进行RhD吸收放散试验,结果为阳性
                photometer DNA 定量分析仪测定 DNA 含量与纯度,                 者共15例。
                样品-20 ℃保存待用。                                      2.2  熔解曲线分析
                1.2.4 熔解曲线分析                                          对 全 部 87 例 样 本 分 别 进 行 RHD exon 9

                    采 用 荧 光 定 量 PCR 分 别 扩 增 RHD exon 9            c.1227G>A 及β⁃actin 荧光定量 PCR 扩增,并对扩增
                c.1227G>A 及β⁃actin(作为内参)。PCR 总体积为                 产物进行熔解曲线分析。前者的 Tm 值约为 73 ℃,
                20 μL,引物浓度为 300 nmol/L,调整 DNA 模板含量                后者约为88 ℃,扩增阳性者分别在相应位置处出现
                约为 50 ng(可以低至至少 1 ng),2×SYBR Green mix            单一峰型。在空白对照结果为阴性的前提下,两种
                10 μL。PCR 条件为:50 ℃温育 2 min,95 ℃ 预变性               熔解峰均出现时,判定为 RHD exon 9 c.1227G>A 阳
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