Page 125 - 第10期
P. 125
第41卷第10期 马 玲，刘太香，薛 敏. 采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究［J］.
2021年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（10）：1542-1545 ·1543 ·
理委员会批准。 10 min，之后95 ℃ 变性15 s，60 ℃退火延伸 1 min共
1.1.2 主要试剂和仪器 40 个循环。所有反应均设 3 个复孔，并以水为模板
IgG/IgM 型抗 D 试剂（Sanquin 公司，荷兰）；IgG 设空白对照。PCR 反应结束后，使用仪器默认的熔
型抗D 试剂（上海血液生物医药有限责任公司）；基 解曲线分析程序（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，
因组 DNA 提取试剂盒（北京原平皓生物公司）；2× 60 ℃ 15 s）进行分析，期间连续监测荧光信号，根据
Taq PCR Mix（南京博尔迪生物科技有限公司）； 熔解温度（melting temperature，Tm）值的差异进行基
SYBR Green Master（Roche，瑞士）；人类红细胞 RhD 因分型。
基因分型试剂盒（PCR⁃SSP）（天津秀鹏生物技术）； 1.2.5 对比研究
Labofuge 400R 低温高速离心机（Heraeus 公司 德 采用商品化 RHD 阴性鉴定基因检测试剂盒
国）；ND⁃100⁃Spectrophotometer DNA 定量分析仪 （PCR⁃SSP 法）对上述标本进行同步检测，严格按说
（NanoDrop 公司 美国）；Alphalmager HP 凝胶成像系 明书操作。PCR 反应条件为：96 ℃ 2 min，随后
统、ABI 7300扩增仪（Applied Biosystem公司，美国）。 96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，5 个循环；96 ℃ 20 s，65 ℃ 50 s，
1.2 方法 72 ℃ 45 s，10 个循环；96 ℃ 20 s，62 ℃ 50 s，72 ℃
1.2.1 血清学试验 45 s，15 个循环；72 ℃ 5 min，最后4 ℃保存。PCR扩
采用间接抗人球试验的方法，使用 3~4 种不同 增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳（100 V，30 min），用
克隆的 IgG 或 IgM/IgG 型抗 D 试剂进行 RhD 阴性确 凝胶成像系统分析结果。
认。对于结果为阴性的样本进行吸收放散试验，检 1.2.6 RHD基因测序
［7］
测是否为 Del 型。具体操作步骤参考文献方法 并 参考文献方法 ，对 RHD 外显子 9 进行测序分
［9］
略为修改，吸收用试剂为IgG/IgM型抗D与IgG型抗 析，PCR 总体积为 20 μL，引物浓度为 200 nmol/L，
D试剂混合使用，吸收时间为1 h。 PCR 条件为：95 ℃，5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，
1.2.2 引物设计 72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR
查找GenBank数据库中RHD基因序列（序列号 产物经纯化后直接进行测序分析，测序引物同扩增
为NG007494），针对1227A特异性位点，应用Primer 引物。使用 Sequencing Analysis 6 和 SeqScape v3.0
5 引物设计软件进行扩增引物设计。经过预实验， 软件进行测序图谱分析和序列比对。
优化后的引物序列参见表1。另采用引物β⁃actin作 1.3 统计学方法
［8］
为内参序列 。 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计数资料采
用例数和构成比进行统计描述，并通过配对χ 检验
2
表1 荧光定量PCR所用引物
比较熔解曲线法与PCR⁃SSP 法结果的差异；采用灵
基因 引物序列（5′→3′） 产物大小（bp）
敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率和
1227A F：GACCAAGTTTTCTGGAAA 140
约登指数等指标对熔解曲线法进行评判。P < 0.05
R：ATGCTCCTTACTCCATTTT
为差异有统计学意义。
β⁃actin F：GCG CCG TTC CGA AAG TT 137
R：CGG CGG ATC GGC AAA
2 结 果
1.2.3 基因组DNA提取 2.1 血清学结果
离心吸取孕妇白膜层细胞，按照DNA提取试剂 87例标本中，RhD确认试验结果阳性者6例；对
盒操作要求提取基因组DNA，采用ND⁃100⁃Spectro⁃ 其余81例标本进行RhD吸收放散试验，结果为阳性
photometer DNA 定量分析仪测定 DNA 含量与纯度， 者共15例。
样品-20 ℃保存待用。 2.2 熔解曲线分析
1.2.4 熔解曲线分析 对 全 部 87 例 样 本 分 别 进 行 RHD exon 9
采 用 荧 光 定 量 PCR 分 别 扩 增 RHD exon 9 c.1227G>A 及β⁃actin 荧光定量 PCR 扩增，并对扩增
c.1227G>A 及β⁃actin（作为内参）。PCR 总体积为 产物进行熔解曲线分析。前者的 Tm 值约为 73 ℃，
20 μL，引物浓度为 300 nmol/L，调整 DNA 模板含量 后者约为88 ℃，扩增阳性者分别在相应位置处出现
约为 50 ng（可以低至至少 1 ng），2×SYBR Green mix 单一峰型。在空白对照结果为阴性的前提下，两种
10 μL。PCR 条件为：50 ℃温育 2 min，95 ℃ 预变性 熔解峰均出现时，判定为 RHD exon 9 c.1227G>A 阳
