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第41卷第3期 须怀沙，王易欣，陈旭锋，等. 甲基苯丙胺引起BV2小胶质细胞炎性反应：基于Toll样受体⁃Peli1信号
2021年3月 通路的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（03）：324-330 ·325 ·

mediated inflammatory signal plays an important role in the process of microglial inflammatory response induced by Meth. Therefore，
the TLRs⁃Peli1 signal axis may be a promising target for the intervention of Meth neurotoxicity，which displays significant application.
［Key words］ methamphetamine；Toll like receptors；Peli1；neuroinflammation；BV2 cell
［J Nanjing Med Univ，2021，41（03）：324⁃330］

甲基苯丙胺（methamphetamine，Meth），俗称冰 国），Anti⁃β⁃actin（Sigma Aldich 公司，美国），HRP 标
毒，其滥用已成为世界性公共卫生问题，Meth 滥用 记的二抗：HRP Goat Anti⁃Rabbit IgG（H+L）、HRP
表现为肝脏、肾脏、免疫、精神、神经多组织多系统 Goat Anti⁃Mouse IgG（H+L）、HRP Goat Anti⁃Rat IgG
［1］
损伤，甚至导致死亡 。研究显示，神经系统是Meth （H+L）（Jacksonimmuno公司，美国），PVDF膜及ECL
作用的主要靶器官，因其损伤导致的学习记忆能力 发光液（Millipore 公司，美国），Lipofectamin 2000 转
下降、海马区体积缩小、多巴胺能神经元特异性凋 染试剂（Thermo Fisher Scientific 公司，美国），Peli1
亡等神经退行性病变虽近年来引起人们的广泛关 siRNA、TLR siRNA 及对照组 siRNA（上海吉玛公
注 ，但其毒性作用及机制仍有待明确。神经炎性 司），TNF⁃α及IL⁃6 ELISA试剂盒（R&D公司，美国）。
［2］
反应被认为是 Meth 滥用引起神经元损伤的主要机 1.2 方法
制之一，涉及脑中小胶质细胞的激活伴随大量炎性 1.2.1 细胞培养
因子的释放。利用体外实验，我们前期研究发现， 将 BV2（小鼠小胶质细胞）培养于 DMEM（含
Meth 暴 露 可 引 起 Toll 样 受 体（Toll like receptors， 10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素）培养液，置于细
TLR）⁃4的高表达，伴随下游炎性通路丝裂原活化蛋 胞培养箱（37 ℃、5% CO2 ）培养2~4 d，隔天更换培养
白激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）及 液。该细胞经Meth处理后，进行后续实验。
核因子（nuclear factor，NF）⁃κB的激活 ，然而Toll样 1.2.2 蛋白免疫印迹分析
［3］
受体家族包含多个亚型受体，Meth暴露是否可引起 将细胞PBS清洗后，用含Cocktail的蛋白裂解液
其他亚型 TLR 表达改变，TLR 与下游信号通路如何 （RIPA，1∶500）裂解，离心后取上清，利用 BCA 蛋白
进行信号传递？这些问题仍不清楚。因此，本研究 试剂盒进行定量。每孔泳道加入30 μg蛋白进行电
通过Meth暴露后对TLR的表达，下游接头蛋白髓样 泳，将蛋白转至PVDF膜，利用5%脱脂奶粉溶液进行
分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、 封闭，并与一抗进行预孵过夜。次日，与二抗孵育
β干扰素 TIR 结构域衔接蛋白（TIR⁃domain⁃contain⁃ 1 h，将ECL发光液A液、B液（1∶1）均匀覆于膜上，置
ing adaptor inducing interferon⁃β，TRIF）及泛素化蛋 于Bio⁃Rad凝胶成像系统成像。Western blot条带经
白E3泛素连接酶Pellino 1（Peli1）的探讨，旨在阐述 Image J软件进行灰度扫描分析。
TLR⁃Peli1轴在Meth 引起小胶质细胞炎性反应中的 1.2.3 ELISA检测炎性因子
作用，从而为Meth神经毒性的干预提供潜在靶点。 在孔板上设标准品孔 8 孔，在第 1 孔加标准品
200 μL，然后从第 1 孔取 100 μL 加到第 2 孔（第 2~8
1 材料和方法
孔都含有标准品稀释液），混匀后，再从第 2 孔取出
1.1 材料 100 μL加入第3孔，依次进行梯度稀释，最后一孔仅
BV2 细胞系来自 ATCC（美国），Meth（北京中国 为稀释液不再添加标准品。稀释后各孔加样量都
食品药品检定研究所，标准品号：171212，纯度 为 100 μL，浓度分别为 1 000.0、500.0、250.0、125.0、
99.9%），DMEM（Hyclone 公司，美国），胎牛血清 62.5、31.3、15.7、0 ng/mL。Meth与BV2细胞孵育24 h

（Gibco 公司，美国），BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo 后，取其上清 10 μL，加入到预先加有 90 μL 稀释液
Scientific 公司，美国），Anti⁃TLR3、Anti⁃TLR4、Anti⁃ 的孔中（即每孔100 μL），孵育2 h，洗涤，每孔加入酶
TLR8、Anti⁃TLR11、Anti⁃TRIF、Anti⁃MyD88（Abcam 标抗体工作液1 h，洗涤后，加入底物工作液100 μL，
公司，美国），Anti⁃TLR7（Santa Cruz公司，美国），Anti 反应20 min后加入50 μL终止液，混匀，在492 nm波
⁃NF⁃κB p65、Anti⁃Phospho NF⁃κB p65（Cell Signaling 长下测定其吸光度值。该实验分别重复 3 次（即细
Technology 公司，美国），Anti⁃Peli1（Santa Cruz，美 胞与 Meth 染毒 3 次），每次每个样本设 3 个平行复