Page 20 - 南京医科大学学报自然科学版
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第40卷第6期41卷第3期
                                                                                                  第
                                                                                                   2021
               ·326 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2020年6月年3月

              孔，数据以均数±标准差（x ± s）形式表示。                             A  400                B  250
                                                                                   *                     *
              1.2.4 实时定量PCR                                          300                   200
                                                        TM
                  提取 BV2 细胞 mRNA 后，通过 PrimeScript RT                 （ ng/mL）  200        （ ng/mL）  150
              reagent Kit 反转录试剂（TaKaRa 公司，日本），取                      TNF⁃α                IL⁃6  100
                                                           TM        100                    50
              0.5 μg mRNA 将其逆转录成 cDNA，按 PrimeScript
              reagent Kit 试剂盒说明书进行扩增，重复 3 次，每次                         0  对照组    METH组       0  对照组    METH组
              平行复孔5个，β⁃actin作为内参，通过2             -ΔΔCt 法对结果        A：Meth 处理 BV2 细胞 24 h 后，TNF⁃α分泌水平的变化；B：Meth
              进行定量。                                             处理 BV2 细胞 24 h 后，IL⁃6 分泌水平的变化。与对照组相比，P <
                                                                                                            *
              1.2.5 BV2细胞siRNA干扰                                0.001（n=3）。
                  为研究 Peli1、TLR4 在 Meth 引起炎性因子释放                    图1 Meth对小胶质细胞TNF⁃α、IL⁃6分泌的影响
              中的作用，将 BV2 细胞分为对照组（不做任何处                          Figure 1  Effects of Meth on TNF⁃α and IL⁃6 excretion in
                                                                         BV2 cells
              理）、NC组（加入对照siRNA）、Meth组（加入Meth处
              理），NC+Meth 组（加入对照 siRNA 和 Meth 处理），               察了 Meth 对小胶质细胞 TLR 家族中 4、7、8 亚型受
              SiPeli1 组（加入 Peli1 siRNA 处理），SiTLR4+Meth 组        体蛋白的表达（图 2A~D）。将 BV2 细胞分别与 0、
             （加入 TLR4 siRNA 和 Meth 处理），SiPeli1+Meth 组           100、300、900 μmol/L Meth 孵育 24 h，发现 TLR7、
             （加入 Peli1 siRNA 和 Meth 处理）。siRNA 由上海吉              TLR8蛋白表达量随Meth浓度的增加而升高，差异有
                                             5
              玛制药技术有限公司设计，将5×10 个细胞接种于6                         统计学意义（P < 0.05）。接着，利用300 μmol/L Meth
              孔板（不含抗生素）中，利用Lipofectamine 2000进行                 与BV2细胞分别孵育0、6、12、24、48 h（图2E~G），发
              转染，用 200 μL Opti⁃MEM I Reduced Serum Medium       现TLR7、TLR8在Meth作用24 h时表达最高。
             （Thermo Fisher Scientific 公 司 ，美 国）稀 释 ，加 入             上述受体皆可通过MyD88这一接头蛋白传递炎
              Peli1 siRNA，室温静置 20 min，形成 siRNA⁃转染试              性信号，而TLR3是唯一通过TRIF这一接头蛋白传递
              剂混和物，将siRNA⁃转染试剂混和液加入含有细胞                         下游信号的 ，因此，本研究亦观察了Meth对TLR3表
                                                                          ［6］
              及培养液的孔中，均匀混和。在37 ℃的CO2培养箱中                        达的改变，不同浓度Meth（0、100、300、900 μmol/L）与
              培养，6 h 后可将培养基换为含血清的完全培养基；                         BV2细胞孵育24 h后，TLR3表达呈浓度依赖性增高
              24 h后在蛋白水平观察Peli1干扰后的表达水平。                        （图3A、B），而将Meth与BV2细胞孵育不同时间（0、
              1.3  统计学方法                                        6、12、24、48 h）后，发现 TLR3 在 12 h 及 24 h 时间点
                  使用SPSS20.0软件进行统计学分析，多组定量                      上调，后逐渐恢复（图3C、D）；此外，本研究亦观察了
              资料比较采用单因素方差分析（one⁃way ANOVA）检                     TLR11 在 Meth 作用后的改变。Meth 作用 BV2 细胞
              验，多组间数据两两比较用 Dunnett⁃t 检验，两组定                     后，TLR11 的表达显著上升（图 3E、F），与 BV2 细胞
              量数据比较用 Student’s t test，P < 0.05 为差异有统            分别孵育不同时间点后（图3G、H），与对照组相比，
              计学意义，绘图使用GraphPad Prism 7.0。                      各时间点的TLR11表达显著增高（P < 0.05）。
                                                                2.3 Meth对接头蛋白MyD88及TRIF通路表达的影响
              2  结 果
                                                                     接 着 对 TLR 介 导 的 下 游 MyD88 依 赖 型 和
              2.1  Meth对小胶质细胞IL⁃6、TNF⁃α表达的影响                    MyD88 非依赖型 TRIF 信号通路进行了探讨。不同
                  基于我们前期工作中 Meth 的使用浓度结合                        浓度 Meth 处理 BV2 细胞 24 h 后，TRIF 蛋白表达增
              Meth滥用后在人体液中浓度的报道               ［4-5］ ，300 μmol/L  高，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05，图
              Meth用来处理小胶质细胞24 h。Meth作用后，利用                      4A、C）；此外，300 μmol/L Meth与BV2细胞孵育不同
              ELISA检测细胞上清液炎性因子的浓度，结果显示，                         时间，TRIF 在各时间点均表达增高，其中 24 h 时间
              Meth 处理的 BV2 细胞分泌的 IL⁃6、TNF⁃α的含量与                 点 TRIF 的表达达到峰值（图 4B、D）。此外，MyD88

              对照组比较显著上升，差异有统计学意义（P <                            在 Meth 暴露后，亦有明显增加的趋势，且差异有统
              0.001，图1A、1B）。                                    计学意义（图A、B、E、F，P < 0.05）。

              2.2  Meth对多种亚型TLR蛋白的作用                            2.4 Meth对小胶质细胞Peli1蛋白表达的影响
                  TLR在引发小胶质细胞IL⁃6及TNF⁃α表达及分                          Peli1蛋白在TLR4介导的小胶质细胞炎症反应
              泌过程中发挥重要作用。因此，我们在蛋白水平观                            中起“桥梁”作用，因而本研究探讨了 Meth 对小胶
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