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第41卷第4期 丁喜艳，王成虎，曹国凡，等. 原发性开角型青光眼一家系的基因突变和临床表型分析［J］.
2021年4月 南京医科大学学报（自然科学版），2021，41（04）：604-608 ·605 ·

tical coherence tomography，OCT）等检查。 Analyzer上进行分析。再将测序结果在家系成员中
1.2.2 基因组提取 进行共分离验证，观察是否有与突变位点相一致的
对参与研究的家系成员及正常对照组100例健 基因与表型共分离现象。
康人采集外周静脉血2~5 mL（EDTA抗凝）。使用血
2 结 果
液基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技
有限公司）提取样本 DNA，使用 Nanodrop 2000 对 2.1 POAG家系系谱结构
DNA进行质检，质检合格后进行下一步实验。 该 POAG 家系共 6 代 55 例成员（图 1），其中男
1.2.3 高通量测序 27例，女28例。参加本研究的家系成员共3代27例，
使用标准文库构建试剂盒（北京迈基诺自主研 其中男15例，女12例（表1）。参与研究的家系成员
发）进行基因组文库构建。用 Covaris⁃S220 超声波 中12例为POAG患者，3例为无症状携带者，12例为
打断仪将基因组 DNA 随机打断成 100~700 bp 的片 无明显体征者，不存在性别差异，且疾病以垂直方
段，末端修复加碱基A，与Illumina PE 接头寡核苷酸 式逐代遗传，遗传方式符合常染色体显性遗传。
混合物连接，用磁珠法对产物进行纯化。对纯化产 2.2 家系成员的临床表现
物进行聚合酶链式反应，扩增纯化后得到 DNA 文 2.2.1 Ⅱ2分支家系调查
库，使用 Nanodrop 2000 和琼脂糖凝胶电泳对文库 Ⅱ2分支家系中，因Ⅲ1、Ⅲ2分支现定居于苏州地
进行质量检测。 区，未能对其进行临床和实验室相关检查，但电话
本研究采用目标序列捕获探针GenCap（北京迈 联系并结合其他近亲属提供的病史，此分支中Ⅲ1分
基诺）对先证者已知的遗传性青光眼疾病相关候选 支无青光眼患者，Ⅲ 2、Ⅳ 2系青光眼患者，Ⅴ 2具体病史
基因外显子区域进行捕获。将构建好的基因组文 不详。Ⅲ 3分支中，已行手术治疗3例（Ⅲ 3、Ⅳ 4、Ⅳ 5 ），
库与经过生物素标记的目标区域捕获探针进行杂 已行选择性激光小梁成形术（selective laser trabecu⁃
交，用链霉亲和素修饰的磁珠共价结合生物素标记 loplasty，SLT）治疗2例（Ⅳ 6、Ⅴ 4 ），所有手术及SLT治
的探针，从而抓取目的基因，最后用磁力架吸附携 疗患者术后眼压均平稳，未行药物控制眼压。Ⅴ5未
带目的基因的磁珠，洗脱纯化，富集目标区域 DNA 检测到基因变异，Ⅴ 6检测出 p.C245Y 变异基因，由
片段。借助Illumina HiSeq X Ten测序仪对捕获的外 于其年龄较小，我们推测其将来有发展为开角型青
显子区域进行高通量测序。 光眼的可能，需定期随访视力、眼压、视野、视神经
1.2.4 生物信息学分析 纤维层厚度。Ⅲ4未行抗青光眼及任何激光治疗，32
将原始测序数据去除污染和接头序列，然后利 岁确诊为POAG时已双眼失明，视力仅存眼前数指，
用BWA软件将过滤后的序列与NCBI数据库人类基 后未采取手术治疗，现长期局部药物控制眼压，我
因组参考序列比对。利用GATK软件分析得出单核 们推测该患者发病年龄更早。Ⅳ 8 31岁时已先后行
苷酸变异（SNP）和插入缺失突变（INDEL）的相关信 双眼抗青光眼手术，现术后未用药物，监测眼压稳
息。通过 ANNOVAR 软件对所有的 SNP 和 INDEL 定。此分支家系中所有青光眼患者均检测出 p.
进行注释。筛选正常人数据库中频率小于 0.05 的 C245Y变异基因，Ⅴ 8检测到变异，但因年幼，暂无明
突变位点，正常人数据库包括千人基因组计划和 显体征，仍需密切观察。
EXAC等。错义突变使用REVEL、SIFT、PolyPhen⁃2、 2.2.2 Ⅱ3分支家系调查
Mutation Taster 和 GERP++等软件进行致病性预测 此分支家系中POAG患者共8例（Ⅱ 3、Ⅲ 5、 7、 8、 9、
和保守性预测，剪切位点的改变用 SPIDEX 等软件 Ⅳ 10、 16、 17 ）。先证者Ⅳ 17 21岁发病，手术时右眼视力
分析其致病性。结合疾病遗传模式和患者临床表 丧失明显，视野检测不出，双眼视神经萎缩，杯盘比接
征进行综合分析，筛选出可疑候选变异。 近1.0，左眼视野缺损，双眼视盘血管OCT，提示双眼
1.2.5 Sanger测序验证候选致病基因 视盘神经纤维层厚度较正常变薄，双眼视盘周边血
在除先证者以外参与研究的家系成员及对照 流密度较正常降低（图 2）。其母Ⅲ 8双眼手术后 16
组 100 例健康人中，利用 PCR 和 Sanger 测序验证经 年，确诊年龄为38岁。Ⅲ5双眼手术后25年，具体发
分析筛选后，得到候选变异位点。利用Primer 3.0在 病年龄无法提供。Ⅳ 10双眼术后23年，可见结膜下功

线软件设计 PCR 引物。PCR 扩增产物使用 3130XL 能性滤过泡（图3）。Ⅲ 6家系分支中无1例患者。Ⅲ 7
测序仪进行毛细管电泳测序并在 ABI 3130 Genetic 现年58岁，双眼术后20年，其子Ⅳ16现年35岁，31岁