Page 140 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第1期
·134 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年1月

重扩增体系的摸索，最终建立起一个7重扩增体系，
1 材料和方法
分别包括肺炎支原体、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞
1.1 材料 菌、金黄色葡萄球菌、阴沟杆菌、白色假丝酵母菌、
引物由金斯瑞生物科技有限公司合成，磁珠法 鲍曼不动杆菌。其引物设计如表1所示。扩增体系
病毒总核酸提取试剂盒（西安天隆科技有限公司）， 为 50 μL：ddH2O 34.5 μL，10×Taq buffer 5 μL，dNTP
毛细管电泳仪（Bioptic，江苏光鼎生物公司）。 Mix1μL，Primer Pool 4.0 μL，模 板 5 μL，Taq 酶
1.2 方法 0.5 μL。单重PCR扩增条件方案：95 ℃ 5 min；95 ℃
1.2.1 对象 15 s、55~60 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s（10个循环）；95 ℃ 15 s、

随机收集南京市儿童医院2020年11—12月266 55~60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（20 个循环）；72 ℃ 5 min。
例儿童呼吸道病原体临床检测剩余样本。 多重 PCR 扩增条件方案：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、
1.2.2 痰液处理及核酸提取 58 ℃40 s、72 ℃ 30 s（10 个循环）；95 ℃ 15 s、60 ℃
本研究创造性使用了一种高效核酸释放剂，使 30 s、72 ℃ 30 s（20个循环）；72 ℃ 5 min。
得细菌的细胞壁以及病毒的核衣壳充分破裂，核酸 1.2.4 毛细管电泳检测
更加充分地释放出来。同时释放的核酸尤其是一 取1 μL 扩增后核酸样本，使用毛细管电泳仪对
些病毒的核酸是 RNA，RNA 非常不稳定，通过加入 PCR扩增产物进行检测。
RNA 酶抑制剂和 RNA 保护剂等，最大程度防止 1.2.5 临床样本检测
RNA 的降解；又针对细菌核酸提取，在裂解液中加 采用上述建立方法检测266例临床检测剩余样本。
chelex⁃100 提高核酸纯度。通过以上方式的优化，
2 结 果
在痰液样本被充分液化的基础上，样本中的细菌或病
毒被充分纯化，同时将后续核酸的提取时间从传统的 2.1 7 种呼吸道病原体单重 PCR 产物毛细管电泳
柱膜法或磁珠法的30~60 min缩短到仅需约8 min，核 检测分析
酸释放量也是传统方法的两倍左右。 对 7 种呼吸道病原体：MP、S.au、KP、P.Ae、Ecl、
1.2.3 引物设计、PCR扩增体系及条件建立 Cal、Aba 分别进行单重 PCR 扩增，产物经毛细管电
我们利用相同的嵌合引物来设计特异引物，首 泳后均检测到相应片段，无明显的感染杂峰出现，
先确定基本的 PCR 反应体系，进行单重 PCR，筛选 引物设计合理（图 1）。
出最佳基因特异性引物浓度。按照上述引物浓度 2.2 7 种呼吸道病原体多重 PCR 扩增结合毛细管
以及PCR促进剂浓度［四甲基氯化铵（TMAC）、甜菜 电泳检测分析
碱、BSA、四甲基亚砜（TMSO）、海藻糖等］，进行了多 对 7 种呼吸道病原体逐步进行多重 PCR 扩增，

表1 本文所使用引物
引物名称 引物序列（5′→3′） 退火温度（℃）
肺炎支原体 AGGTGACACTATAGAATAAGACCCCTCCAATCCTTATCG 61
GTACGACTCACTATAGGGAGGTTGCATCCTTCACCTTCAA 63
肺炎克雷伯菌 AGGTGACACTATAGAATAGAGAGCGACTCCAGCCAGAA 62
GTACGACTCACTATAGGGACGCCGAAATCATAGCTTAACG 63
铜绿假单胞菌 AGGTGACACTATAGAATAGTTGTTCATCGTGTTCCCCTT 59
GTACGACTCACTATAGGGACGCACCAATACTTACGGCATT 63
金黄色葡萄球菌 AGGTGACACTATAGAATACACCTGAAACAAAGCATCCTAA 58
GTACGACTCACTATAGGGAATACGCTAAGCCACGTCCAT 63
白色假丝酵母菌 AGGTGACACTATAGAATAGACCGTTCATTTGCTCAAYTATAT 58
GTACGACTCACTATAGGGATTGACCACCCATAAGAATACCA 62
鲍曼不动杆菌 AGGTGACACTATAGAATAGAGTCACTTATTTGCGACCACC 60
GTACGACTCACTATAGGGAGCGGAAAGCTCATCTTGTTCAT 63
阴沟杆菌 AGGTGACACTATAGAATAGTTACCCCCCTGATGAAAGC 61
GTACGACTCACTATAGGGAATCGCCACCTAATACGCCG 64