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第43卷第10期 汪徐春，孙玉洁. 增强子调控异常与恶性肿瘤的关系研究进展［J］.
2023年10月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（10）：1432-1440，1478 ·1437 ·

chromatin with high⁃throughput sequencing，ATAC⁃seq） 组具有增强子活性的DNA序列，因此无法反映内源
技术，大规模并行报告基因检测（massively parallel 性染色质环境的增强子活性。GRO⁃seq能够定量活
reporter assay，MPRA）和自转录活性调控区域测序 性增强子合成的eRNA。它通过先冻结胞核内转录
（self⁃transcribing active regulatory region sequencing， 过程，再在体外恢复的方法，使体外合成的新生转
STARR⁃seq），新 生 RNA 测 序（global nuclear run⁃ 录本中含有 NTP 类似物 BrU（bromouridine），通过
on sequencing，GRO⁃seq）等；②增强子的靶基因鉴 BrU 抗体富集后建库测序，分析RNA 体外合成的位
定及其功能研究，这些技术包括染色质构象捕获 置和丰度。2020年，Wang等 ［71］ 通过分析GRO⁃seq数
（capturing chromosome conformation，3C）及其衍生技 据，在7种肿瘤细胞系中鉴定了活性增强子。

术，间隔成簇短回文重复序列⁃核酸酶 9（clustered 6.2 增强子的靶基因鉴定及其功能研究
regularly interspaced short palindromic repeats⁃associ⁃ 确定增强子的靶基因是探讨增强子生物学功
ated9，CRISPR⁃Cas9）和CRISPR⁃钝化Cas9（CRISPR⁃ 能的重要环节。3C 及其衍生技术为鉴定增强子的
dead Cas9，CRISPR⁃dCas9）等。 靶基因提供了重要手段 ［72］ 。3C 技术的基本原理：
6.1 分析鉴定增强子及其活性的方法 用甲醛固定活细胞以稳定 DNA 和蛋白质的相互作
随着对增强子特征的认识和高通量技术的快 用后，先用合适的内切酶消化 DNA，再用连接酶连
速发展，近年来人们主要利用增强子的表观修饰特 接，然后通过逆交联使 DNA 与蛋白质分离，提取
征，结合二代测序的技术方法对全基因组中潜在增 DNA，最后在连接位点两侧设置引物进行 PCR 反
强子进行分析和鉴定。最常用的 ChIP⁃seq 技术是 应，从而定性和定量检测一对一的增强子启动子相
通过富集增强子特征修饰的组蛋白或转录因子结 互作用 ［17］ 。高通量染色体构象捕获（high⁃resolution
合的 DNA 序列，再通过测序在全基因组鉴定潜在 chromosome conformation capture，Hi⁃C）技术的出现，
增强子。2017 年，Skene 等 ［68］ 优化该技术开发出 使得从全基因组水平分析染色质相互作用成为可
CUT&RUN，CUT&RUN通过微球菌核酸酶进行抗体 能。Hi⁃C 是在3C 技术的连接步骤中加入生物素标
靶向的特定蛋白质⁃DNA 酶切和纯化，再测序分析， 记的寡核苷酸，进行平末端连接，DNA 纯化和超声
［73］
具有细胞起始量低、实验周期短和信噪比高等优 后，对寡核苷酸进行高通量测序 。
点。此外，利用ATAC⁃seq对染色质开放区域的分析 利用CRISPR⁃Cas9技术敲除细胞中某段增强子
有助于增强子的鉴定。Tn5转座酶与Tn5转座子形 序列或者通过构建 sgRNA 文库随机敲除基因组中
成转座复合物，通过切割靶DNA序列将Tn5转座子 的增强子元件已成为研究增强子功能的重要手
插入其中。只有 DNA 与组蛋白结合松散时，Tn5 转 段。已有研究利用 CRISPR⁃Cas9 技术敲除调控癌
座酶才能酶切并完成转座。ATAC⁃seq 利用这一特 基因表达的增强子，研究增强子在肿瘤发生中的作
点，将改造后携带测序接头的 Tn5 转座酶加入细胞 用机制 ［28］ 。在 CRISPR⁃Cas9 基础上发展起来的
核中，Tn5转座酶首先在染色质开放区域进行酶切， CRISPR⁃dCas9 技术，不仅能直接改变基因组序列，
然后再完成已知测序接头的转座，通过建库测序分 还能在特定位置引入表观修饰。基于 CRISPR/
析染色质可及性。有研究者使用 ATAC⁃seq 结合 dCas9技术，人们通过增强子CRISPR激活（enhancer
ChIP⁃seq对含有间充质型胃癌的特征性增强子进行 CRISPR activation，enCRISPRa）和 增 强 子 CRISPR
全基因组分析 。 抑制（enhancer CRISPR interference，enCRISPRi）系
［69］
除了分析鉴定基因组中的增强子，还可利用 统在体内局部重塑增强子，从而研究增强子的调
MPRA、STARR⁃seq和GRO⁃seq等技术直接分析增强 控功能 。
［74］
子的活性。经典的MPRA技术是先给待测增强子标 6.3 研究增强子的常用数据库
记特有的条形码序列，再分别将每个增强子克隆到 近年来数据库的开发和应用也为增强子的研
pGL4.23 载体，对应的条形码序列克隆到荧光素酶 究提供了便利，充分利用相关数据库将大大提高
基因的 3′UTR，通过 RNA⁃seq 检测条形码序列的丰 研究效率。研究增强子的常用数据库主要包括：
度来反映增强子的活性。作为 MPRA 的升级版， ENCODE 数据库（https：//www.encodeproject.org/）和
［75］
STARR⁃seq 技术以增强子序列本身作为条形码序 Cistrome数据库（http：//cistrome.org/db/#/） ，其收录
列，通过自转录及丰度检测来反映增强子活性 ［70］ 。 了许多正常组织和肿瘤组织中增强子特征性组蛋
这两种方法均是在外源性环境中批量检测全基因 白修饰及转录因子的 ChIP⁃seq 和 ATAC⁃seq 可视化