Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第3期
·306 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年3月

表1 PCR引物
Table 1 Primers for PCR

基因名称 上游序列（5′→3′） 下游序列（5′→3′）
LINC01518 CAGTGACGGAACAGTACCAG TCACAAACATCCCGCTCT
LINC00265 AGCACCAGGGCGGAAGGAAG CCAAGCGGGAAGGAGACTAGGAG
PSMA3⁃AS1 TGCACAACCACATGAGGAAGAAGG TGAGTCCATGCCAGTTGCCTTTAG
LINC01347 TCAGGAAGGCTTTCTACTAATG CACTTCGCAAGAACCACAA
DLGAP1⁃AS1 GAGCCCCCTCGTGTTTGATG AAAAGGGCAGTGTCACAGGTG
OIP5⁃AS1 TGCGAAGATGGCGGAGTAAG TAGTTCCTCTCCTCTGGCCG
SNHG17 GTTCCTGGGGCTTGGATGAT GATCTAAGGCTGAGACCCACG
NUTM2A⁃AS1 CAGGCAACGTGTTGGACCTTCC CTGAGGCAGGCGGATCATTTCG
LINC01194 ACCTCGGGATGACTATGGC TTGCGGTGAAAGTGGCTC
BBOX1⁃AS1 CCGCTGACAGGTCTAGGAGTACAC GGAGTCTGACTGCTCTTCAAAGGG
GAPDH CAAGGTCATCCATGACAACTTTG GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

转染 H1299 细胞 48 h，在明确转染效率可达 70%以 甘氨酸5 min，用0.5% Triton X⁃100 PBS脱色10 min，

上后进行实验分组：①pcDNA3.1 组；②pcDNA3.1/ 加 Appllo 染色液避光孵育 30 min 后用 Hoechst 染色
LINC01518组。此外，采用同前方法将shLINC01518 液避光孵育30 min。在荧光镜下观察拍摄5个随机
质粒转染细胞后48 h（效率可达80%）再用IL⁃17刺激 选择的视野。
3 h。实验分组：①shCTR+IL⁃17组；②shLINC01518⁃1+ 1.2.8 克隆形成实验
IL⁃17组；③shLINC01518⁃2+IL⁃17组；④shLINC01518⁃3 过表达或沉默 LINC01518 分组同 1.2.6 所述。
+IL⁃17 组。提取前述不同处理细胞的总 RNA，行 当细胞培养 8 d 出现肉眼可见的克隆时终止培养。
Real⁃time PCR检查。 先弃去培养液，再用 PBS 浸洗，接着加甲醇固定
1.2.6 CCK⁃8实验 20 min后弃去，再加结晶紫染液染20 min，洗去染色
IL⁃17 刺激 H1299 和 PC9 细胞。实验分组：① 液，干燥后用肉眼直接计数细胞克隆的形成数量。
DMEM组：两种细胞仅用无血清DMEM培养；②IL⁃17 1.3 统计学方法
刺激组：取50 ng/mL 的 IL⁃17（课题组以往研究确定 采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，使用
［6］
该浓度为最佳刺激剂量） ，每孔加 150 μL，在刺激 GraphPad Prism 8 软件进行绘图。所有实验均独立
后不同时间加CCK⁃8溶液处理。 重复3次，所得定量数据以均数±标准差（x ± s）进行
过表达 LINC01518。实验分组：①pcDNA3.1 统计描述。Student’s t 检验用于比较两组间差异；
组 ；② pcDNA3.1/ LINC01518 组 ，将 pcDNA3.1 或 多组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采
pcDNA3.1/LINC01518 转染 H1299 细胞 48 h。处理 用 SNK 检验，明确对照组的比较采用 Dunnett⁃t 检
后加CCK⁃8溶液。 验，P < 0.05为差异有统计学意义。
沉默LINC01518后再加IL⁃17刺激。实验分组：
2 结 果
①shCTR 组，仅转染 shCTR 48 h；②shCTR+IL⁃17
组，将 shCTR 转梁 H1299 细胞 48 h 再行 IL⁃17 刺激 2.1 3种NSCLC细胞系均有IL⁃17RA的明显表达
48 h；③shLINC01518+IL⁃17 组，将 shLINC01518 转 Western blot 检测 NSCLC 细胞表面的 IL⁃17RA，
染 H1299 细胞 48 h 再行 IL⁃17 刺激 48 h。最后每孔 结果显示，这些细胞均有IL⁃17RA的表达，H1299和
加10 μL CCK⁃8溶液，37 ℃孵育40 min，用酶标仪测 PC9细胞表达较多（图1A、B）。
定 450 nm 处的吸光度值，以吸光度值表示细胞的 2.2 IL⁃17 刺激 H1299 和 PC9 细胞不同时间可引起
增殖水平。 细胞的增殖
1.2.7 EdU实验 在证实了 H1299 和 PC9 细胞可表达 IL⁃17RA
过 表 达 或 沉 默 LINC01518 的 分 组 处 理 同 后，为了确定 IL⁃17 刺激能诱导细胞增殖，用 IL⁃17
1.2.6。每孔细胞先加100 μL 50 μmol/L EdU 溶液孵 （50 ng/mL）刺激细胞，在刺激0、24、48、72、96 h时行

育2 h，再用4%多聚甲醛孵育30 min，接着加2 mg/mL CCK⁃8 实验检测细胞增殖水平，发现 IL⁃17 刺激后