Page 15 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 15

第43卷第3期          阮玉婷，李 雅，葛 文，等. LINC01518对IL⁃17诱导非小细胞肺癌细胞增殖的影响［J］.
                  2023年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：304-310                        ·305 ·


                    非 小 细 胞 肺 癌（non ⁃ small cell lung cancer，     1.2  方法
                                               ［1］
                NSCLC）是发病率较高的恶性肿瘤 。研究表明，                          1.2.1 细胞系的培养与传代
                NSCLC的致病因素除了遗传、环境和吸烟外，还与患                             将 PC9、H1299、H1975 和 BEAS⁃2B 接种于含
                者肺部的慢性炎症及促炎因子增多密切相关                    ［2-3］ 。白   10%胎牛血清的 DMEM 完全培养液中，于 37 ℃、5%
                介素（interleukin，IL）⁃17 是一种促炎细胞因子，在                 CO2培养 48 h。当细胞融合度达 90%时按 1∶5 比例
                多种癌组织内显著表达，能促进癌细胞的异常增                             进行传代。
                殖 ［4-6］ 。本课题组过去已证实，NSCLC 患者的癌组                    1.2.2 Western blot

                织中，IL⁃17 及 IL⁃17 受体 A（IL⁃17 receptor A，IL⁃            将细胞裂解物离心3 min，取20 μL蛋白行SDS⁃
                17RA）均明显表达，且用IL⁃17刺激NSCLC 细胞，上                    PAGE 电泳。先 45 V 恒压浓缩再 120 V 电泳 2 h，
                调的 HMGA1（high mobility group protein A1）还能通       0.3A 恒流湿转 120 min。PVDF 膜用脱脂牛奶封闭
                过增强cyclin D1引起细胞的增殖反应 。                           2 h后加相应一抗4 ℃孵育过夜，漂洗后用HRP标记
                                                 ［6］
                    当细胞受到刺激后，除了信号分子、转录因子                          的二抗孵育1 h。最后行ECL化学发光试剂检测。

                明显激活或表达外，还能测到某些长链非编码RNA                           1.2.3 RT⁃PCR
               （long non⁃coding RNA，LncRNA）的表达上调与下                    用IL⁃17分别刺激PC9和H1299细胞，TRIzol提
                调 ［7-18］ 。LncRNA 是长度≥200个核苷酸且多无编码                 取细胞的总 RNA，逆转录为 cDNA（留作模板）。同
                蛋白功能的 RNA，能对基因的表达进行调控                    ［7-18］ 。  时查阅相关文献      ［7-18］ ，并从前期芯片结果（即上调2倍
                文献报道，LncRNA 在 NSCLC 癌组织内表达可影响                     以上的 LncRNA 459 个）中挑选出上调较高且已报
                癌细胞的侵袭、转移及增殖等多个过程                 ［9-10］ 。        告有促增殖效应的10个LncRNA进行RT⁃PCR检查
                    长链非编码RNA 01518（long intergenic non⁃pro⁃       验证。检测前 Premier 5 软件设计的引物由合肥通
                tein coding RNA 01518，LINC01518）是一种基因间            用生物科技有限公司合成，序列见表1。
                的LncRNA，能参与不同疾病的发生与发展。例如：                             RT⁃PCR 反应总体系为 25 μL，含 cDNA 模板
                在食管癌组织中，LINC01518 的表达上调能竞争结                       1 μL，Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，
                合 miR⁃1⁃3p，诱导细胞的过量增殖          ［11-12］ 。此外，在青      灭菌双蒸水补足至总体积。用ABI Simpli Amp PCR
                光眼患者肌腱囊成纤维细胞中，LINC01518也可海绵                       热循环仪进行PCR反应，程序为：95 ℃ 15 min变性，
                化 miR⁃216b⁃5p 来增强转化生长因子（transforming              55 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸；共35个循环。
                growth factor，TGF）⁃β1诱导的增殖反应 。                    1.2.4 Real⁃time PCR
                                                 ［13］
                    本课题前期研究已发现，用IL⁃17刺激NSCLC细                         同 上 设 计 合 成 LINC01518、LINC00265 和
                胞（H1299和PC9）3 h，LINC01518的表达水平已明显                 PSMA3⁃AS1引物（序列见表1）。Real⁃time PCR反应
                提高，然而IL⁃17是否通过LINC01518引起NSCLC细                   体系为20 μL，含cDNA模板1 μL，SYBR Green Master
                胞增殖，目前尚不知晓，故本研究进行了探讨。                             Mix 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，双蒸水补足总体
                                                                  积。用 ABI Step One Plus 定量 PCR 仪进行扩增反
                1  材料和方法
                                                                  应，程序为：预变性，95 ℃ 5 min；循环反应，95 ℃ 10 s，
                1.1  材料                                           60 ℃ 30 s，共 40 个循环；熔解曲线，95 ℃ 15 s、60 ℃
                    人正常支气管上皮细胞系 BEAS⁃2B 和 NSCLC                   60 s、95 ℃ 15 s。数据以β⁃actin 作为内参，2       -ΔΔCT 法计
                细胞系 PC9、H1299 和 H1975（武汉中国典型培养物                   算相对表达量，Graphpad Prism 5进行半定量分析。

                保藏中心）。胎牛血清（南京维森特公司），IL⁃17RA                       1.2.5 质粒的构建与鉴定
                抗体（武汉ABclonal公司），Lipofectamine 2000（赛默                过 表 达 的 pcDNA3.1/LINC01518 和 小 干 扰 的
                飞公司，美国），人 IL⁃17（R&D Systems 公司，美国）；               shLINC01518 质粒（含 shLINC01518⁃1~3）分别由合
                CCK⁃8试剂盒（南京诺唯赞公司），EdU试剂盒（广州                       肥通用生物和上海吉玛制药技术有限公司构建。
                锐博公司）；pcDNA3.1/LINC01518（合肥通用公司），                 shLINC01518⁃1：5′⁃CCCGTACCTAGTTCTTAAA⁃3′；

                shLINC01518（上海吉玛公司）；ABI Simpli Amp PCR            shLINC01518 ⁃ 2 ：5′ ⁃ ATGCCAACTTATCTGGCTA ⁃
                热循环仪和 ABI Step One Plus 定量 PCR 仪（赛默               AT⁃3′；shLINC01518⁃3：5′⁃TGGCCTAGATCATTAA⁃
                飞公司，美国），倒置显微镜 IX73（奥林巴斯公司，                        CATAT⁃3′。测序鉴定证实，上述质粒均构建成功。
                日本）。                                                  将 pcDNA3.1/LINC01518 用 Lipofectamine2000
   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20