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第45卷第10期             王 勇，丁 磊，董汇昱，等. APOE对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响［J］.
                 2025年10月                  南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（10）：1435-1442，1512                   ·1437 ·


                胞系中提取和纯化总 RNA 并验证其浓度和纯度，                          将 1 mL 含 10%胎牛血清的培养基倒入每个培养室
                使用 FastKing RT 试剂盒逆转录为 cDNA。以 cDNA                的下部，再培养 48 h。用棉签拭去残留在膜上表
                为 模 版 使 用 Talent SYBR Green qPCR 试 剂 盒 在          面的细胞，将膜下表面的细胞用甲醇固定 0.5 h，
                QuantStudio 7 Flex 仪器上进行 qRT⁃PCR，条件为              再用 0.1%结晶紫染色 0.5 h，清水清洗小室后，使
                95 ℃ 2 min预变性；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，      用倒置显微镜拍摄通过 Transwell 小室膜的细胞，
                40 个循环；72 ℃ 5 min。PCR 引物序列如下，APOE                 每孔随机拍摄至少 3 个视野，最后统计穿过膜的细
               （F：5′⁃GTTGCTGGTCACATTCCTGG⁃3′，R：5′⁃GCAG⁃           胞数量。
                GTAATCCCAAAAGCGAC ⁃ 3′），GAPDH（F：5′ ⁃ CT⁃          1.2.8  EdU实验检测细胞增殖能力
                GGGCTACACTGAGCACC⁃3′，R：5′⁃AAGTGGTCGTT⁃                前列腺癌细胞（LNCap、DU⁃145、PC⁃3 细胞）培
                GAGGGCAATG ⁃ 3′ ）；实 验 重 复 3 次 ，APOE 的             养至状态良好。转染质粒 48 h 后收取各组细胞。

                                                      -ΔΔCt  进行   配制2×EdU工作液（20 μmol/L），37 ℃预热后等体积
                mRNA 水平用 GAPDH 作为对照，并使用 2
                标准化。                                              加入 6 孔板中，继续孵育细胞 2 h，去除培养液并加
                1.2.4  Western blot检测蛋白的表达情况                      入1 mL固定液，室温固定15 min。去除固定液，每孔
                    使用细胞裂解液裂解细胞，总蛋白提取试剂盒                          用1 mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3~5 min。去除洗
                获得细胞中的总蛋白，并使用 BCA 蛋白检测试剂盒                         涤液，每孔加 1 mL 通透液室温孵育 10~15 min。去
                测定蛋白浓度。样品经十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯                             除通透液，每孔用 1 mL 洗涤液洗涤细胞 1~2 次，每
                酰胺凝胶电泳后，转移到聚偏氟乙烯膜上。加入脱                            次 3~5 min。每孔加入 0.5 mL Click 反应液，轻轻摇
                脂牛奶阻断 2 h，然后加入特异性兔抗人APOE抗体                        晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
               （1∶1 000）在 4 ℃条件下孵育 12 h。 TBS冲洗后，加                 室温避光孵育30 min。吸除Click反应液，用洗涤液
                入HRP标记的山羊抗兔抗体并孵育 1 h，TBS⁃Tween                    洗涤3次，每次3~5 min。在荧光显微镜下观察细胞
                20 冲洗后，使用 Pro⁃light HRP 试剂盒对条带进行染                 增殖情况。
                色和显色。                                             1.2.9  动物造模
                1.2.5  CCK⁃8实验检测细胞活性                                  裸鼠分为 3 组：si⁃NC、si⁃APOE、si⁃APOE+ARi，
                    将转染后的3种人前列腺癌细胞按2×10 个/孔                       每 组 6 只 。 将 浓 度 为 1×10 个/mL 的 经 si⁃NC 或
                                                                                            7
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                的密度接种到 96 孔板中，每组设置 3 个复孔，细胞                       si⁃APOE 转染的 LNCap 细胞悬液 0.1 mL，以皮下
                贴壁后开始，培养不同时间（0、24、48和72 h），每孔                     注射法注入裸鼠的右侧前肢外侧皮下。第 14 天对
                加入 10 μL CCK⁃8 溶液，测量 450 nm 波长下的吸光                si⁃APOE+ARi 组额外给予 0.1 mL 的 200 μmol/kg 剂
                度。为检测LNCap 细胞对药物的敏感度，在细胞贴                         量的雄激素受体抑制剂注射，其余两组注射同等体
                壁后加入不同浓度的阿帕鲁胺培养 96 h。相应地                          积的生理盐水，第 3 天起测量瘤体体积并记录详细
                将 10 μL CCK⁃8溶液加入孔中，在450 nm波长下测                   数据，瘤体积=（长径×短径 ）/2，并绘制时间与肿瘤
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                量吸光度以得到细胞活性。                                      体积的变化曲线。裸鼠持续饲养 3 周后，瘤体直径
                1.2.6  克隆形成实验检测细胞增殖能力                             达 0.5~1.0 cm，表明模型构建成功。接种 LNCap 细
                    取转染后的3种人前列腺癌细胞接种于 6 孔板                        胞期间每天对裸鼠保持密切观察并连续记录移植
                中，密度为200 个/孔，每组设置3个复孔 ，培养 72 h                    瘤体的体积大小以及接种部位有无病理改变，同时
                后，用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 min；加入吉姆萨染                     确认裸鼠未出现明显食欲、活动、反应减少等生理
                色液染色30 min并用PBS 冲洗，拍照并计数。                         变化。第 30 天，将裸鼠立刻进行安乐死，并取成瘤
                1.2.7 Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力                    组织进行称重测量。
                    收集转染后处于对数生长期的各组前列腺癌细                          1.3  统计学方法
                胞，使用0.25% 的胰蛋白酶消化，使用RPMI⁃1640培                        使用SPSS26.0进行数据处理和统计学分析，使

                养基吹打重悬成为细胞悬液；将8 μm孔径的Transwell                    用 GraphPad Prism 8.0 进行绘图。服从正态分布的
                细胞小室放入 24 孔培养板中，按 1×10 个/mL 细胞                    实验数据使用均数±标准差（x ± s）表示。两组间比
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                密度取 200 μL 细胞悬液加入 Transwell 小室上层；                 较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方
                额外使用涂有 80 μL Matrigel 的 Transwell 小室来测            差分析，组间两两比较采用 SNK 法。P < 0.05 为差
                定细胞的侵袭能力。24 h后，小室内细胞基本贴壁，                         异有统计学意义。
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