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第45卷第8期       喻琦钦，杨泽昕，张俊麒，等. 同种异体小鼠肾移植慢性抗体介导排斥反应模型的构建与鉴定［J］.
                  2025年8月                     南京医科大学学报（自然科学版），2025，45（8）：1073-1081                      ·1075 ·


                C57BL/6 肾移植，14 d后切取移植肾。                           1.2.4 移植肾组织免疫荧光染色
                       H2b
                    显微外科手术器械（上海金钟医疗有限公司），                             移植肾组织石蜡包埋，脱蜡后行抗原修复并使
                流式细胞仪（Beckman Coulter 公司，美国），0.2 g/kg             用固定液固定，滴加大鼠抗小鼠C3d抗体4 ℃孵育过
                头孢唑肟、3.5%异氟烷、高渗枸橼酸盐嘌呤溶液（上                         夜，滴加Cy3标记山羊抗小鼠IgG（H+L）室温下避光
                海输血技术有限公司），免疫荧光固定液（上海碧云                           孵育1 h，使用DAPI染细胞核30~60 s后封片保存。
                天生物技术有限公司），C3d 免疫荧光抗体（R&D 公                       1.2.5  免疫组织化学染色（immunohistochemistry，
                司，美国），Cy3 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）（上海碧                    IHC）
                云天生物技术有限公司），DAPI试剂（北京索莱宝科                             移植肾组织石蜡包埋，脱蜡后行抗原修复并使
                技有限公司），鼠兔通用型二抗（南京泰盈生物科技                           用固定液固定，滴加一抗室温孵育过夜，滴加二抗
                有限公司），二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）                避光孵育30 min，滴加显色剂二氨基联苯胺显色，苏
               （中山澳泉医疗科技有限公司），肌酐（creatinine，Cr）                   木精染细胞核30~60 s后脱水封片。
                试剂盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）检测试剂              1.2.6 小鼠移植肾功能检测
                盒（南京建成生物工程研究所），红细胞裂解液（上                               根据试剂盒使用说明检测血清Cr、BUN水平。
                海碧云天生物技术有限公司），小鼠淋巴细胞分离                            1.2.7 流式细胞术检测
                液（深圳达科为生物技术有限公司），PE标记抗小鼠                              流式细胞检测受体小鼠外周血中供体特异性
                                                                                                ［16］
                IgG1抗体（Abcam公司，英国）。                               抗体（donor specific antibody，DSA） 。脱颈处死供
                1.2 方法                                            体 BALB/c 小鼠，取脾脏经研磨、过滤网筛制备为
                                                                           H2d
                1.2.1 皮肤移植                                        细胞悬液。使用红细胞裂解液冰上孵育 10 min 后
                    脱颈处死cABMR组1、cABMR组2、cABMR组3                   重悬，缓慢沿管壁加入小鼠淋巴细胞分离液，离心
                的 BALB/c 供体小鼠，脱除其尾部皮肤，修剪出一                        后吸取中间层淋巴细胞并重悬。稀释5倍待测受体
                         H2d
                块 0.5 cm×0.5 cm 大小的方块皮肤，将皮肤保存于                    小鼠血清，取 50 μL 细胞悬液加入血清至最终稀释
                20 mL 的 4 ℃生理盐水中；aABMR 组 BALB/c 供体                度为1∶10，37 ℃恒温箱孵育30 min后重悬。于重悬
                                                        H2d
                小鼠，脱颈处死后剃除其背部毛发，修剪出一块                             液中加入 PE 标记抗小鼠 IgG1 抗体，避光于冰上孵
                0.5 cm×0.5 cm大小的方块皮肤，将其内侧结缔组织                     育45 min后重悬，流式细胞仪检测脾脏淋巴细胞平
                刮除干净直至真皮组织           ［10］ 。麻醉机以 3.5%异氟烷           均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）即为
                诱导、1.5%异氟烷吸入以维持 C57BL/6 受体小鼠                      受体小鼠外周血DSA水平 。
                                                                                         ［17］
                                                   H2b
                麻醉，对受体小鼠充分消毒和备皮后，在其背部位                            1.3  统计学方法
                置剪下0.4 cm×0.4 cm大小的方形缺损，在供体皮肤                         使用 SPSS26.0、GraphPad Prism9.0.2 统计分析
                的四角及四边使用单纯间断8针缝合皮肤移植物，用                           软件，采用 t 检验，方差分析比较各组间 DSA 水平、
                纱布加压包扎于皮肤移植处，皮下注射0.2 g/kg头孢                       外周血清 Cr、血清 BUN 水平，针对 Banff 评分，采用
                唑肟钠以预防感染，1 d后拆除纱布。                                方差分析比较各条评分细则下的各组分值差异相
                1.2.2 小鼠肾移植手术步骤                                   比对照组是否具有统计学意义，各组小鼠的生存曲
                    根据国际报道方法获取供体左肾，于受体腹腔                          线图采用 Log⁃rank 检验（对数秩检验）进行分析。
                右侧行异位肾脏移植。血管吻合：肾动脉使用带瓣                            C3d 阳性区域半定量分析使用 Image J V1.0 软件。
                Patch的端侧吻合法，肾静脉采用端侧吻合法。保留                         流式结果分析使用 FlowJo_v10.8.1 软件。P < 0.05
                供体肾脏输尿管及伴行血管，采用输尿管膀胱塞入                            为差异有统计学意义。
                法使供体输尿管自然缩入受体膀胱内。术后皮下
                                                                  2  结 果
                注射0.2 g/kg头孢唑肟钠1 mL预防感染。具体手术
                方法参照本研究组之前发表的成果                ［11，15］ 。          2.1  同种异体小鼠肾移植cABMR模型的构建
                1.2.3 移植肾组织病理检测                                       皮肤移植的结果如图 1 所示，移植皮肤贴合在

                    移植肾组织行石蜡包埋，采用苏木精⁃伊红（he⁃                       受体表面，无明显隆起或凹陷，移植第2天受体创面
                matoxylin and eosin，HE）和过碘酸雪夫（periodic acid       周围血管开始向移植皮肤内生长且血运开始恢复，
                ⁃Schiff，PAS）染色，病理组织的诊断标准遵照 Banff                  第 4 天起移植皮肤的温度接近正常皮肤，皮肤弹性
                2019 进行。                                          触感恢复，移植皮肤边缘开始出现淡红色晕圈，表
                   ［9］
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