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第46卷第7期 付太冉，孙传峰，咸 峰. 布比卡因脂通过线粒体钙信号轴影响老年麻醉患者认知功能的机制［J］.
2026年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2026，46（7）：973-982 ·975 ·

mental state examination，MMSE）评分<23 分；饮酒、 储存，用于蛋白质、电子显微镜分析。将部分海马
药物依赖、精神或神经系统疾病史。术后 7 d 采用 组织用O.C.T.化合物包埋，随后在-20 ℃下用冷冻切
MMSE量表评估患者的神经精神功能。MMSE评分< 片机切成20 μm连续冠状切片用于荧光染色。
23分为POCD患者。根据手术后7 d是否出现POCD， 1.2.5 免疫荧光染色
将患者分为 POCD 组（n=15）和非 POCD 组（n=46）。 将连续切片的20 μm厚冠状切片与抗p⁃AMPK、
在麻醉诱导前和手术结束后1 d采集空腹肘静脉血 NeuN抗体在4 ℃下孵育过夜。次日，用PBS洗涤切
2 mL，EDTA抗凝，离心后获得沉淀白细胞。通过酶 片 3 次，并在黑暗中与相应的 FITC 标记二抗或
联免疫吸附测定法检测白细胞线粒体膜呼吸链复 TRITC 标记二抗孵育 1 h，并用 DAPI 重新染色。在
合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性水平。 Olympus Ⅸ⁃81荧光显微镜下观察荧光信号。
1.2.2 BPV诱导小鼠认知障碍模型的建立 1.2.6 电子显微镜
18月龄C57BL/6雄性小鼠购自北京伟通利华动 将海马组织在4 ℃下用2.5%戊二醛固定48 h，然
物技术有限公司。在实验开始前，将小鼠安置在标 后用乙酸铀酰染色，用分级丙酮脱水并包埋在
准实验室环境中，允许自由获取食物和水。动物实 Epon812 试剂中，在放大 10 000 倍的 JEM 1010 透射
验 方 法 经 本 院 伦 理 委 员 会 批 准（ 批 件 号 ： 电子显微镜中观察。每个海马锥体神经元随机选
202300615），符合 3R 原则。然后将 15 只小鼠经股 择10个线粒体（每只小鼠10个神经元，每种分组条
静脉泵注0.5% BPV，速度为2 mg/（kg·min ），分别在 件下3只小鼠）。
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麻醉前（基线）、麻醉后1 d、麻醉后3 d、麻醉后5 d、麻 1.2.7 初级神经元培养和分组治疗
醉后7 d随机选取3只小鼠实施安乐死，并提取海马 参照文献［11］描述的方案，从 C57BL/6 小鼠第
用于蛋白质印迹分析。 17 天胚胎分离得到的皮质中获得初级神经元。将
48 只小鼠随机分为对照组、ASM981 组、POCD 初级神经元铺在聚⁃d⁃赖氨酸包被的平板或培养皿
组和 POCD+ASM981 组，每组 12 只。除对照组、 上，在最初接种24 h后，将胞嘧啶β⁃d⁃阿拉伯呋喃糖
ASM981组外，其他组小鼠经股静脉泵注0.5% BPV， 苷（25 μmol/L）加入培养物中以抑制神经胶质细胞
速度为 2 mg/（kg·min ），对照组小鼠以相同的速度 的增殖。将神经元在37 ℃、5% CO2中培养7~9 d，每
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经股静脉泵注生理盐水 ［10］ 。POCD+ASM981组在股 2 d 更换一半培养基。将神经元暴露于 1 mmol/L
静脉泵注 BPV 前 30 min，腹膜内注射 ASM981（钙调 BPV在不同的时间点（1、3、6、12、24 h），通过蛋白质
神经磷酸酶抑制剂）5 mg/kg。在麻醉后的第 1 天各 印迹法分析Drp1蛋白表达情况。此外，为了考察钙
组随机选取6只小鼠进行行为测试。其余小鼠实施 调神经磷酸酶介导的 Drp1 激活对原代神经元 BPV
安乐死，并提取海马用于后续分析。 刺激的反应，将细胞分为空白对照（Con）组、BPV
1.2.3 行为评估 组 、ASM981 组 、BPV + ASM981 组 。 除 Con 组 、
采用莫里斯水迷宫（Morris water maze，MWM） ASM981 组外，其他组暴露于 1 mmol/L BPV 中 12 h。
测试评估小鼠的空间记忆和学习能力。小鼠的训 BPV + ASM981 组 在 暴 露 于 BPV 前 30 min，加 入
练期为 5 d，每只小鼠每天测试 4 次，每次测试间隔 ASM981（10 μmol/L）。ASM981 组仅加入 ASM981
15 min。在第 5 天移除逃生平台，以评估小鼠的空 （10 μmol/L）处理12 h。
间记忆。记录每只小鼠定位平台所用的时间，即逃 1.2.8 线粒体成像
避潜伏期。在整个过程中，记录以下参数，包括小 原代神经元在 37 ℃、5% CO2中与 Mito Tracker
鼠的游泳轨迹、逃避潜伏期、穿越平台的次数、在平 Red CMXRos 孵育（100 nmo/L），并在FluoView Fv10i
台上的停留时间和到目标象限的距离。 共聚焦显微镜下观察。使用带有线粒体分析仪插
1.2.4 组织收集 件的Image J，从3个独立实验中随机选择20个细胞
在麻醉后的第 1 天对小鼠实施安乐死，用戊巴 用于量化线粒体分支长度。
比妥钠（50 mg/kg，i.p.）麻醉小鼠，用含肝素钠的 1.2.9 蛋白质印迹法（Western blot）
0.9% NaCl 溶液经心脏灌注，然后用 4%多聚甲醛固 使用放射免疫沉淀测定法缓冲液对海马组织
定。充分固定后，取出脑组织，小心剥离海马区，并在 或细胞进行匀浆。通过12 000 g离心20 min收集上
4%多聚甲醛中 4 ℃固定过夜，然后在 10%、20%和 清液，并通过二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒测量蛋
30%蔗糖溶液中分级脱水。将部分海马组织-80 ℃ 白质浓度。通过 SDS⁃PAGE 分离 30 μg 蛋白质样品